Regolamenti UE > Regolamento n. 2568/91 > Allegato X A

Analisi gascromatografica degli esteri metilici degli acidi grassi

OGGETTO

Il presente metodo dà un orientamento generale per l'applicazione della gascromatografia, con l'uso di colonne a riempimento o capillari, per determinare la composizione qualitativa e quantitativa di una miscela di esteri metilici degli acidi grassi ottenuta in conformità con il metodo specificato nell'allegato X B. Il metodo non è applicabile agli acidi grassi polimerizzati.
REAGENTI
1. Gas vettore
  Gas inerte (azoto, elio, argo, idrogeno, ecc.) completamente essiccato ed avente un tenore di ossigeno inferiore a 10 mg/kg.
  Nota 1: L'idrogeno, che viene usato come gas vettore soltanto con colonne capillari, può raddoppiare la velocità dell'analisi, ma è pericoloso; sono disponibili dispositivi di sicurezza.
2. Gas ausiliari
  1. Idrogeno (purezza >99,9 %), esente da impurezze organiche.
  2. Aria od ossigeno, esente da impurezze organiche.
3. Standard di riferimento
  Miscela di esteri metilici di acidi grassi puri oppure esteri metilici di un grasso a composizione nota, di preferenza analogo a quello della sostanza grassa da analizzare. Sarà necessario l'ossidazione degli acidi grassi poliinsaturi.
APPARECCHIATURA

Le istruzioni precisano che deve essere usata la consueta apparecchiatura per gascromatografia, facendo uso di colonne a riempimento e/o capillari nonché di un rivelatore a ionizzazione di fiamma. È consigliabile usare apparecchiatura in grado di garantire l'efficienza e la risoluzione specificate al punto 4.1.2.
1. Gascromatografo
  Il gascromatografo deve comprendere i seguenti elementi.
  1. Sistema ad iniezione
    Usare un sistema ad iniezione:
    a) con colonne a riempimento, aventi lo spazio morto minore possibile (in questo caso il sistema di iniezione deve poter essere riscaldato a una temperatura di 20-50°C superiore a quella della colonna) oppure
    b) con colonne capillari, nel qual caso il sistema di iniezione deve essere appositamente progettato. Esso può essere del tipo a separazione oppure del tipo non a separazione sull'iniettore della colonna.
    Nota 2: In assenza di acidi grassi aventi meno di 16 atomi di carbonio, può essere usato un iniettore ad ago mobile.
  2. Stufa
    La stufa deve essere atta a scaldare la colonna ad almeno 260°C e a mantenere la temperatura desiderata con l'approssimazione di 1°C per la colonna a riempimento e con l'approssimazione di 0,1°C per la colonna capillare. Quest'ultimo requisito è particolarmente importante se si usa una provetta di silice fusa. Il ricorso al riscaldamento programmato è raccomandato in tutti i casi e in particolare per gli acidi grassi aventi meno di 16 atomi di carbonio.
  3. Colonna e riempimento
    1. Colonna costruita in materiale inerte alle sostanze da analizzare (cioè vetro o acciaio inossidabile) e avente le seguenti dimensioni:
      a) lunghezza: 1-3 m. Se sono presenti acidi grassi a catena lunga (oltre C20) dovrà essere usata una colonna relativamente corta. Se invece si analizzano acidi a 4-6 atomi di carbonio, si raccomanda di usare una colonna avente una lunghezza di 2 m.
      b) diametro interno: da 2 a 4 mm.
      Nota 3: Se sono presenti componenti poliinsaturi aventi più di tre legami doppi, essi potranno essere decomposti in una colonna di acciaio inossidabile.
      Nota 4: Può essere usato un sistema di colonne a riempimento gemelle.
    2. Riempimento, comprendente i seguenti elementi:
      a) supporto: terra di diatomee lavata con acido e silanizzata, oppure altro idoneo supporto inerte con una gamma ristretta di granulometria (compresa tra 125 e 200 µm, con variazioni di ± 25 µm); la granulometria media è correlata al diametro interno e alla lunghezza della colonna;
      b) fase stazionaria: tipo di poliestere di liquido polare (ad es. polisuccinato di dietilenglicole, polisuccinato di butandiolo, poliadipato di etilenglicole ecc.), cianosiliconi o qualsiasi altro liquido che consenta la separazione cromatografica richiesta (vedi clausola 5). La fase stazionaria deve essere compresa tra il 5 % (m/m) e il 20 % (m/m) del riempimento. Per alcune separazioni può essere usata una fase stazionaria non polare.
    3. Condizionamento della colonna
      Con la colonna staccata, dalla parte del rivelatore, scaldare gradualmente la stufa a 185°C e far passare una corrente di gas inerte attraverso la colonna di recente preparata ad un flusso compreso tra 20 ml/min e 60 ml/min per almeno 16 h a questa temperatura e per ulteriori 2 h a 195°C.
  4. Colonna capillare
    1. Tubo costituito di materiale inerte alle sostanze da analizzare (di solito vetro o silice fusa). Il diametro interno deve essere compreso tra 0,2 mm e 0,8 mm. La superficie interna deve esser sottoposta a un opportuno trattamento (ad es. preparazione della superficie, inattivazione) prima di essere ricoperto con la fase stazionaria. Nella maggior parte dei casi è sufficiente una lunghezza di 25 mm.
    2. Fase stazionaria, di solito del tipo poliglicole [poli(etilenglicole) 20 000], poliestere (polisuccinato di butandiolo) oppure polisilossano polare (cianosiliconi). Sono adatte le colonne legate (cross-linked).
      Nota 5: Vi è il rischio che i polisilossani polari creino difficoltà nell'identificazione e separazione dell'acido linolenico e degli acidi a C20. Le coperture devono essere sottili, ad esempio 0,1 µm-0,2 µm.
    3. Montaggio e condizionamento della colonna
      Osservare le normali precauzioni necessarie per il montaggio delle colonne capillari, ovvero sistemazione della colonna nella stufa (supporto), scelta e collegamento di giunti (a tenuta stagna), sistemazione delle estremità della colonna nell'iniettore e nel rivelatore (riduzione degli spazi morti). Sottoporre la colonna ad un flusso di gas vettore [ad es. 0,3 bar (30 kPa) per una colonna avente una lunghezza di 25 mm e un diametro interno di 0,3 mm]. Condizionare la colonna programmando la temperatura della stufa a 3°C/min dalla temperatura ambiente a una temperatura di 10°C inferiore al limite di decomposizione della fase stazionaria. Mantenere la stufa a questa temperatura per 1 h fino a stabilizzazione della linea di base. Riportarla a 180°C in modo da lavorare in condizioni di isotermicità.
      Nota 6: Sono disponibili in commercio opportune colonne precondizionate.
  5. Rivelatore, di preferenza idoneo ad essere riscaldato a una temperatura superiore a quella della colonna.
2. Siringa
  La siringa deve avere una capacità massima di 10 µl ed essere graduata in divisioni di 0,1 µl.
3. Registratore
  Se la curva di registrazione deve essere usata per calcolare la composizione della miscela analizzata, è necessario un registratore elettronico di alta precisione compatibile con l'apparecchiatura usata. Detto registratore deve avere le seguenti caratteristiche:
  a) tasso di risposta, al di sotto di 1,5 s, di preferenza 1 s (il tasso di risposta è il periodo necessario affinché la punta di registrazione passi dallo 0 % al 90 % a seguito dell'introduzione improvvisa di un segnale del 100 %);
  b) ampiezza della carta, minimo 20 cm;
  c) velocità della carta, adattabile a valori compresi tra 0,4 cm/min e 2,5 cm/min.
4. Integratore o calcolatore (facoltativo)
  Un calcolo rapido ed accurato può essere effettuato con l'ausilio di un integratore o calcolatore elettronico. Quest'ultimo deve dare una risposta lineare con una sensibilità adeguata e la correzione della deviazione della linea di base deve essere soddisfacente.
PROCEDIMENTO

Nelle operazioni descritte dal paragrafo 4.1 al paragrafo 4.3 si fa accenno all'uso di un rivelatore a ionizzazione di fiamma. Come alternativa può essere usato un gascromatografo munito di catarometro (che funziona in base al principio della variazione di conducibilità termica). Le condizioni di funzionamento vengono pertanto modificate come descritto nella clausola 6.
1. Condizioni dell'analisi
  1. Selezione delle condizioni operative ottimali
    1. Colonna a riempimento
      Nella scelta delle condizioni per effettuare la prova, devono essere prese in considerazione le seguenti varianti:
      a) la lunghezza ed il diametro della colonna;
      b) la natura e la quantità della fase stazionaria;
      c) la temperatura della colonna;
      d) il flusso di gas vettore;
      e) la risoluzione necessaria;
      f) le dimensioni del campione da analizzare, scelto in modo che il collegamento tra il rivelatore e l'elettrometro diano una risposta lineare;
      g) la durata dell'analisi.
      In linea di massima i valori riportati nella tabella 1 e nella tabella 2 danno i risultati auspicati, cioè almeno 2 000 piatti teorici per metro di lunghezza della colonna per quanto si riferisce allo stearato di metile, e l'eluizione dello stesso entro 15 minuti circa. Se l'apparecchiatura lo consente, l'iniettore deve trovarsi a una temperatura di circa 200°C ed il rivelatore a una temperatura pari o superiore a quella della colonna. Di norma, il rapporto tra il flusso dell'idrogeno fornito al rilevatore a ionizzatore di fiamma e quello del gas vettore varia tra 1:2 e 1:1 in funzione del diametro della colonna. Il flusso dell'ossigeno è di circa 5-10 volte quello dell'idrogeno.
      Tabella 1
      Diametro interno della colonna mm Flusso del gas vettore ml/min
      2 da 15 a 25
      3 da 20 a 40
      4 da 40 a 60
      
      Tabella 2
      Concentrazione della fase stazionaria % (m/m) Temperatura della colonna °C
      5 175
      10 180
      15 185
      20 185
    2. Colonna capillare
      Le caratteristiche di efficienza e di permeabilità delle colonne capillari indicano che la separazione tra i costituenti e la durata dell'analisi sono ampiamente dipendenti dal flusso del gas vettore nella colonna. È pertanto necessario ottimizzare le condizioni operative influenzando questo parametro (o più semplicemente la pressione di testa della colonna), a seconda che si desideri migliorare le separazioni o effettuare un'analisi rapida.
  2. Determinazione del numero di piatti teorici (efficacia) e risoluzione (vedi figura 1)
    Effettuare l'analisi di una miscela di stearato di metile e di oleato di metile in proporzioni più o meno equivalenti (ad es. esteri metilici del burro di cacao). Scegliere la temperatura della colonna e il flusso di gas vettore in modo che il massimo del picco dello stearato di metile venga registrato circa 15 minuti dopo il picco del solvente. Usare un quantitativo sufficiente della miscela di esteri metilici in modo che il picco dello stearato di metile occupi circa tre quarti della scala intera. Calcolare il numero dei piatti teorici, n (efficienza), con la formula:
    n = 16 {[dr (I) H] / [W (I)]}²
    e la risoluzione R usando la formula:
    R = 2D / [W(I) + W (II)]
    dove:
    dr (I) = è la distanza di ritenzione, in millimetri, dall'inizio del cromatogramma fino al massimo del picco dello stearato di metile;
    W(I) e W(II) = sono le ampiezze, in millimetri, del picchi rispettivamente dello stearato di metile e dell'oleato di metile, misurati tra i punti d'intersezione delle tangenti ai punti di inflessione della curva con la linea di base;
    D = è la distanza, in millimetri, tra i picchi massimi dello stearato di metile e dell'oleato di metile.
    Figura 1
    Cromatogramma per la determinazione del numero di piatti teorici (efficienza) e risoluzione
    
    (un click sull'immagine per ingrandirla)
    Le condizioni operative da scegliere sono quelle idonee ad almeno 2 000 piatti teorici per metro di lunghezza della colonna per quanto si riferisce allo stearato di metile e una risoluzione di almeno 1,25.
2. Sostanza da analizzare
  Usando la siringa (3.2) prendere 0,1 µl-2 µl della soluzione di esteri metilici preparata conformemente all'allegato X B e iniettarli nella colonna. Nel caso di esteri non in soluzione, preparare una soluzione di circa 100 mg/ml in eptano di qualità cromatografica ed iniettare da 0,1 µl a 1 µl di questa soluzione. Se l'analisi riguarda costituenti presenti soltanto in tracce, la quantità di sostanza da analizzare può essere aumentata (fino a 10 volte).
3. Analisi
  Di norma le condizioni operative sono quelle di cui al paragrafo 4.1.1.
  È possibile tuttavia operare a una temperatura inferiore della colonna quando si tratta di determinare acidi grassi aventi meno di 12 atomi di carbonio oppure a una temperatura più elevata quando si tratta di determinare acidi grassi con oltre 20 atomi di carbonio. All'occasione, è possibile programmare la temperatura in entrambi questi casi. Ad esempio, se il campione contiene gli esteri metilici degli acidi grassi con meno di 12 atomi di carbonio, iniettare il campione a 100°C (oppure da 50°C a 60°C se è presente acido butirrico) e raggiungere immediatamente la temperatura a un tasso compreso tra 4°C/min e 8°C/min in condizioni ottimali. In taluni casi possono essere associati i due procedimenti. Dopo il riscaldamento programmato, continuare l'eluizione a temperatura costante finché tutti i componenti sono stati eluiti. Se lo strumento non prevede il riscaldamento programmato, usarlo a due temperature fisse comprese tra 100°C e 195°C. Se necessario, si raccomanda di effettuare un'analisi su due fasi fisse a polarità differente per verificare l'assenza di picchi mascherati, ad esempio nel caso della presenza contemporanea di C18:3 e C20:0 oppure C18:3 e C18:2 associati.
4. Preparazione del cromatogramma di riferimento e dei grafici di riferimento.
  Analizzare la miscela standard di riferimento (2.3) nelle stesse condizioni operative di quelle usate per il campione e misurare i tempi di ritenzione o le distanze di ritenzione per gli acidi grassi costituenti. Su carta semilogaritmica, per qualsiasi grado di insaturazione, costruire i grafici che mostrano il logaritmo del tempo o della distanza di ritenzione in funzione del numero di atomi di carbonio. In condizioni isotermiche, i grafici relativi ad acidi a catena lineare aventi lo stesso grado di insaturazione devono essere linee rette. Queste linee devono essere all'incirca parallele. È necessario evitare condizioni in cui si possano verificare i "picchi mascherati", ovvero nei quali la risoluzione è insufficiente a separare due costituenti.
ESPRESSIONE DEI RISULTATI
1. Analisi qualitativa
  Identificare i picchi dell'estere metilico del campione dai grafici preparati al paragrafo 4.4, se necessario per interpolazione.
2. Analisi quantitativa
  1. Determinazione della composizione
    A parte casi eccezionali, usare il metodo di normalizzazione interno, cioè presumere che la totalità dei componenti del campione siano rappresentati sul cromatogramma, in modo che il totale delle aree sotto i picchi costituisca il 100 % dei costituenti (eluizione totale). Se nell'apparecchiatura è previsto un integratore, usare i dati da esso ottenuti. In caso negativo, determinare l'area sotto ciascun picco moltiplicando l'altezza del picco per l'ampiezza a metà altezza e, se necessario, prendere in considerazione le varie attenuazioni usate durante la registrazione.
  2. Metodo di calcolo
    1. Caso generale
      Calcolare il contenuto di un dato componente I, espresso come percentuale in massa degli esteri metilici, determinando la percentuale rappresentata dall'area del picco corrispondente relativa alla somma delle aree di tutti i picchi, usando la formula seguente:
      (å A / Ai) * 100
      dove:
      Ai = è l'area sotto il picco corrispondente al componente i;
      å A = è la somma delle aree sotto tutti i picchi.
      Esprimere il risultato con l'approssimazione di una decimale.
      Nota 7: In questo caso generale, si ritiene che il risultato del calcolo basato sulle aree relative rappresenti una percentuale in massa. Per i casi nei quali questa asserzione non è giustificata, vedi 5.2.2.2.
    2. Uso dei fattori di correzione
      In taluni casi, ad esempio in presenza di acidi grassi aventi meno di 8 atomi di carbonio oppure di acidi aventi gruppi secondari, quando si usano rivelatori di conduttività termica oppure quando è necessario il grado più elevato di accuratezza, devono essere usati fattori di correzione che convertano le percentuali delle aree e dei picchi in percentuali in peso dei componenti. Determinare i fattori di correzione con l'ausilio di un cromatogramma derivato dall'analisi di una miscela di riferimento di esteri metilici di composizione nota, effettuata in condizioni operative identiche a quelle usate per il campione. Per questa miscela di riferimento, la percentuale in peso del componente i è data dalla formula:
      (mi / å m) * 100
      dove:
      mi = è il peso del componente i nella miscela di riferimento;
      å m = è il totale delle masse dei vari componenti della miscela di riferimento.
      Dal cromatogramma della miscela di riferimento (4.4) calcolare la percentuale (area/area) del componente i come segue:
      (Ai / å A) * 100
      dove:
      Ai è l'area sotto il picco corrispondente al componente i,
      å A è la somma delle aree sotto tutti i picchi.
      Il fattore di correzione viene quindi calcolato come segue:
      Ki = (mi * å A) / (Ai * å m)
      Di norma i fattori di correzione vengono espressi facendo riferimento a KC16 sicché i fattori relativi diventano:
      K'i = (Ki / KC 1 6)
      Per il campione il contenuto di ciascun componente espresso come percentuale in degli esteri metilici è:
      (K'i * Ai) / [å (K' i * Ai)] * 100
      Esprimere i risultati con l'approssimazione di una decimale.
    3. Uso di uno standard interno
      In alcune analisi (ad es. quando non tutti gli acidi grassi sono quantificati, ad esempio quando sono presenti acidi con 4 e 6 atomi di carbonio accanto ad acidi con 16 e 18 atomi di carbonio, oppure quando è necessario determinare il quantitativo assoluto di un acido grasso in un campione) è necessario ricorrere ad uno standard interno. Vengono spesso usati acidi grassi con 5,15 o 17 atomi di carbonio. Deve essere determinato l'eventuale fattore di correzione per lo standard interno.
      La percentuale in peso del componente i, espressa come esteri metilici, è data dalla formula:
      (ms * K'i * Ai) / (m * K's * As) * 100
      dove:
      Ai è l'area sotto il picco corrispondente al componente i;
      As è l'area sotto il picco corrispondente allo standard interno;
      K'i è il fattore di correzione per il componente i (relativo a KC 1 6);
      K's è il fattore di correzione dello standard interno (relativo a KC 1 6);
      m è il peso, in milligrammi, della sostanza da analizzare;
      ms è il peso, in milligrammi, dello standard interno.
      Esprimere i risultati con l'approssimazione di una decimale.

Diametro interno della colonna mm	Flusso del gas vettore ml/min
2	da 15 a 25
3	da 20 a 40
4	da 40 a 60

Concentrazione della fase stazionaria % (m/m)	Temperatura della colonna °C
5	175
10	180
15	185
20	185

CASO SPECIALE - USO DI UN CATAROMETRO (FUNZIONANTE IN BASE AL PRINCIPIO DEI MUTAMENTI DI CONDUTTIVITÀ TERMICA)

Per la determinazione della composizione qualitativa e quantitativa di una miscela di esteri metilici degli acidi grassi può essere usato altresì un gascromatografo associato a un rivelatore funzionante in base al principio dei mutamenti di conduttività termica (catarometro). Se quest'ultimo viene usato, le condizioni specificate alle clausole 3 e 4 devono essere modificate come indicato nella tabella 3.
Per l'analisi quantitativa, usare i fattori di correzione definiti al paragrafo 5.2.2.2.

Tabella 3

VARIABILE	VALORE/CONDIZIONI
Colonna	Lunghezza: da 2 m a 4 m Diametro interno: 4 mm
Supporto	Granulometria compresa tra 160 µm e 200 µm
Concentrazione della fase stazionaria	Dal 15 % (m/m) al 25 % (m/m)
Gas vettore	Elio oppure, in mancanza di quest'ultimo, idrogeno, col tenore più basso possibile di ossigeno
Gas ausiliari	Nessuno
Temperatura dell'iniettore	Da 40°C a 60°C al di sopra di quella della colonna
Temperatura della colonna	Da 180°C a 200°C
Flusso del gas vettore	Di norma tra 60 ed 80 ml/min
Entità del campione di sostanza iniettato	Di norma tra 0,5 µl e 2µl

RELAZIONE SULLA PROVA

La relazione sulla prova deve specificare i metodi usati per la preparazione degli esteri metilici e per l'analisi gascromatografica nonché i risultati tenuti. Essa deve citare altresì tutti i dettagli operativi non specificati nella presente norma internazionale oppure considerati come facoltativi, nonché i particolari di qualsiasi evento che possa avere influenzato i risultati. La relazione sulla prova deve comprendere tutti i dati necessari per la completa identificazione del campione.

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